(non GLP1R target drugs) treatment group did not show distinct fluorescence spots, while the Byetta (GLP1Ragonists) treatment group showed lots of fluorescence spots (activation of GLP1R). Conclusion Rin-m5F/GL-P1R-GFP, the model for GLP1R agonist screening, has been successfully constructed. This model is rapid and基金项目：国际科技合作与交流专项(No.2013DFG32060)。
作者简介：胡涌泉，男，在读硕士研究生，主要从事细胞生物学、分子营养研究，E-mail：bookhulai@sina.cn * 通讯作者：刘东波，男，教授，博士研究生导师，主要从事亚健康干预基础和应用技术研究，Tel：(073184617244，E-mail：chinasaga@163.com786Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6 中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期糖尿病是由遗传因素、病毒感染、自由基毒素、细胞因子等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退，肝脏、骨骼肌、脂肪组织等发生胰岛素抵抗进而引发的一系列代谢紊乱综合征[1-4] 。临床上以高血糖(空腹血糖> 7.0 mmol·L- 1 ，餐后血糖> 11.1mmol·L- 1 )为主要特点 [5] 。糖尿病患者组织器官长期处于高血糖状态会引发诸多并发症，导致心脑血管、肝、肾眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈[6-8] 。胰 高 血 糖 素 样 肽 1(GLP1) 因 与 GLP1 受 体(GLP1R)结合后可刺激胰岛素分泌并抑制胰高血糖素分泌，已成为近些年糖尿病药物开发的重要靶点[9] 。已有的 GLPlR 激动剂类药物均属于大分子多肽类，不能口服给药，长期服用会产生诸多不良反应，且保存与运输条件要求严苛[10-11] 。因此需要寻找不良反应少且疗效长期稳定的 GLP1R 小分子激动剂药物。目前基于 GLPlR 为靶点构建的高通量 GLP1 激动剂筛选模型主要从受体与配体结合、检测胞内第二信使 cAMP、构建受体功能反应报告基因三个方面进行[12] 。但这些筛选模式假阳性高、筛选时间长、筛选效低，严重制约了 GLP1 类似物小分子药物的开发。因此建立筛选 GLPlR 激动剂模的研究变得尤为迫切。本文研究目的是建立一种新的 GLPlR 激动剂类药物筛选方法：构建稳定表达绿色荧光蛋白人 GLP1R 细胞模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP并通过阳性药物百泌达、阴性药物格列本脲验证该模型应用于 GLPlR 激动剂类物筛选的效果。
1 材料
1.1 细胞
株大鼠胰岛素瘤细胞株(Rin-m5F)(上海通派生物科技有限公司)。
1.2 试药
pCMV6-AC-GLP1R-GFP 质粒(湖南农业大学刘东波教授惠赠)，RMPI 1640 培养基(Gibco)，胎牛血清(BI)，谷氨酰胺(TransGen)，0.25%EDTA- 胰酶(TransGen)，X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent(Roche)G418(Sigma)，防荧光淬灭封片剂(Southern Biotech)，多聚甲醛(Sigma)，GLP1R抗体(Abcam)，GAPDH 抗体(Yataihengxin)，羊抗小鼠 IgG1 二抗(Southern Biotech)，羊抗兔 IgG1 二抗，一次性过滤器(Millex)，一次性注射器(上海治宇)，圆形盖玻片、载玻片(世泰)，细胞培养板(Corning)等。
1.3 仪器
CO 2 恒温细胞培养箱(美国 SHELLAB)，倒置显
微镜(上海荼明光学 BXP-106)，倒置荧光显微镜(日本 OLYMPUS)，激光共聚焦荧光显微镜(Zeiss LSM710)，超净工作台(苏州净化设备有限公司，SW-CJ-IFD)，Countess 自动细胞计数仪(Life Technologies)，电子天平(型号 JL3003，JENNER)，超纯水仪(Milli-RO Plus，millipore)等。
2、方法
2.1 细胞培养
细胞复苏后置于 25 cm 2 培养瓶中，在 37℃，5%CO 2 条件下培养，具体方法见参考文献[13] 。
